一、elisa實(shí)驗步驟介紹

　　樣品收集、處理方法

　　1、血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細胞刺激，室溫血液自然凝固10-20分鐘，2000-3000rpm離心20分鐘，將血清和紅細胞迅速小心地分離，收集上清，保存過(guò)程中如出現沉淀，應再次離心。

　　2、血漿：根據標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑?；旌?0-20分鐘后，2000-3000rpm離心20分鐘。收集上清，保存過(guò)程中如出現沉淀，應再次離心。

　　3、細胞上清液：檢測分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。2000-3000rpm離心20分鐘，收集上清。

　　4、組織勻漿：標本采集后用液氮迅速冷凍保存備用。使用時(shí)取適量標本，加入一定量的PBS，用手工或勻漿器將標本勻漿充分后，2000-3000rpm離心20分鐘，收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

二、樣品保存

　　如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

　　實(shí)驗步驟

　　1、從室溫平衡20分鐘后的鋁箔袋中取出所需酶標板孔數目，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

　　2、標準品和樣本加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL。樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL，空白孔不加。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

　　3、加酶：標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔。

　　4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60分鐘。

　　5、配液：將20X濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后備用。

　　6、洗滌：小心揭開(kāi)封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

　　[洗板方法]

　　手工洗板：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體，酶標板倒扣在吸水紙上拍干，反復5次。

　　自動(dòng)洗板：每孔注入洗液350μL，浸泡1分鐘，洗板5次。

　　7、顯色：每孔加入底物A、B各50μL，輕輕震蕩混勻后，37℃避光孵育15min。

　　8、終止：每孔加入終止液50μL，終止反應，此時(shí)藍色立刻轉為黃色。

　　9、測定：以空白孔調零，15分鐘內在450nm波長(cháng)處測定各孔的吸光度（OD值）。

三、elisa實(shí)驗結果計算

　　繪制標準曲線(xiàn)：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)，按曲線(xiàn)方程計算各樣本濃度?；蛴脴藴饰锏臐舛扰cOD值計算出標準曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實(shí)際濃度。

四、elisa實(shí)驗步驟注意事項

　　1、試劑盒保存在2–8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì )有結晶，屬于正?，F象，可水浴加熱使結晶*溶解后再使用。初次使用試劑盒時(shí)，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。

　　2、要嚴格避免操作過(guò)程中酶標板干燥，干燥會(huì )使酶標板上生物成份迅速失活。

　　3、禁止混用不同批次試劑盒內的試劑。

　　4、本公司提供的96孔酶標板是單條可拆型酶標板，用戶(hù)可按需求使用;剩余的酶標板請放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

　　5、請每次測定的同時(shí)做標準曲線(xiàn)，最好做復孔。