EHA101感受態(tài)細胞

產(chǎn)品規格CAT#: BFNC86103-01(10×100ul)/BFNC86103-02(50×100ul) /BFNC86103-03(100×100ul)

EHA101：                                                                  100μl/支
pK7WGF2（control vector，10ng/μl )                            10μl
保存條件(保質(zhì)期)：                                         -80℃（12個(gè)月）

基因型

C58 (rif^R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kan^R) Nopaline

產(chǎn)品說(shuō)明

EHA101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti質(zhì)粒含有篩選標簽：kan，賦予EHA101菌株和卡那霉素抗性，適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉基因操作。

青旗生物生產(chǎn)的EHA101化學(xué)轉化感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pK7WGF2質(zhì)粒（壯觀(guān)霉素抗性）檢測轉化效率>10⁴ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 取-80℃保存的農桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰中。

2.每100 μl感受態(tài)加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（轉化效率較高，*使用前盡量做預實(shí)驗確定所加質(zhì)粒的量），用手bo打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

3. 加入700 μl無(wú)抗生素的LB或YEB液體培養基，于28℃，200 rpm振蕩培養2~3小時(shí)。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天。

（當平板只含有轉化所用雙元載體抗生素時(shí)，28℃培養48小時(shí)即可；平板中同時(shí)加入雙元載體抗生素，20 μg/ml rif 時(shí)，需28℃培養60小時(shí)；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養72-90小時(shí)）。

EHA101感受態(tài)細胞

備注

1、農桿菌相關(guān)抗生素配方：

2、常用農桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

3、LB及YEB配方：

注意事項

1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉化效率下降一個(gè)數量級。

2. 混入質(zhì)粒時(shí)應輕柔操作，轉化高濃度的質(zhì)?？上鄳獪p少終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養不足，陽(yáng)性克隆生長(cháng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質(zhì)粒用量。

4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml，過(guò)高的利福平濃度不利于農桿菌生長(cháng)，會(huì )降低其生長(cháng)速度和轉化效率。本公司EHA101感受態(tài)計算轉化效率時(shí)所用平板只含有50 μg/ml 壯觀(guān)霉素，若所用平板同時(shí)含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2。

5. 培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(cháng)、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養農桿菌時(shí)不考慮這些抗生素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低 (可以忽略)。